凯氏定氮法,是一种经典的测定蛋白质含量的 方法。其国标规定的基本检测过程包括: 消化: 样 品和消化剂、硫酸一同加热,使蛋白质消化分解并 释放出氨,氨与硫酸结合生成硫酸铵; 蒸馏: 碱化蒸 馏使硫酸铵中的氨游离; 滴定: 用硼酸溶液吸收后 再以硫酸或盐酸标准溶液滴定; 计算: 根据酸的消耗量乘以换算系数,即得出样品中蛋白质含量。整 个过程至少需要 6 h 的时间,其中消化这一过程即 至少需要 3～ 4 h ,耗时较长且操作繁琐。为此,我 们经过长时间的实践操作总结,对凯氏定氮法中消 化这一过程进行了改进,以期达到简化操作,缩短 时间的目的。

1　方法

1. 1　实验分组 分为 2 组: 对照组和实验组。两组在测定样本 蛋白质含量的过程中,采用不同的消化方法,之后 的蒸馏、滴定、计算方法,则完全相同。

1. 1. 1　对照组: 操作严格按照国标规定〔1〕进行。其 采用的消化方法为小火碳化消化法: 取样品稀释液 1. 0mL 与消化剂及硫酸一起加入定氮瓶内,于瓶口 放一漏斗,将瓶以 45° 角斜支于有小孔的石棉网上加 热消化,消化过程要求小火( 400℃) 碳化3 h 左右。

1. 1. 2　实验组: 采用的消化方法是高温消化法: 将样 品稀释液 1. 0 mL 与消化剂一起加入定氮瓶内保持 1 000℃的高温持续加热,其过程要求保持定氮瓶内 液体沸腾,但所产生的蛋白质气泡不溢出瓶口,同时 产生的蒸馏水气体在瓶壁遇冷回流,可以将瓶内壁上 的蛋白质带回瓶底进行消化,整个消化过程大约 1h 。

1. 2　蛋白质含量检测

1. 2. 1　两组方法的稳定性、准确性比较: 分别对 50 g/L蛋白校准液(上海申索)及 15 份人血白蛋白 样品(蛋白含量未知)进行两种方法的蛋白质含量 检测,前者重复 15 次。

1. 2. 2　实验组蛋白回收率检测(见表 1): 任取 2 种 含蛋白的样品A 、B(蛋白含量未知) ,每种样品分别 取3 份各 9. 6 mL,加入 50 g/L 的蛋白标准液 0 μ L、 100 μ L、400 μ L 和分别对应 400 μ L、300 μ L、0 μ L 的生 理盐水,执行4 次重复试验,进行2 种方法的蛋白质 含量检测。最后计算回收率。

1. 3　统计学分析 数据以 x ±SD 表示,两组间结果比较采用配对 资料的 t 检验及回归分析。

2　结果

2. 1　两组方法的稳定性、准确性比较(见图 1) 对50 g/L 蛋白校准液进行蛋白质含量检测结 果,国标消化法为 49. 95 g/L±0. 00 g/L,高温消化 法为 49. 91 g/L±0. 00 g/L,两种方法无显著差异(t =1. 1602, P >0. 05)。蛋白校准液氮含量检测结 果: 国标消化法为8. 20 g/L±0. 00 g/L,高温消化为 8. 21 g/L ±0. 00 g/L,2 种方法无显著差异( t =
1. 000, P >0. 05)。 对人血白蛋白样品进行蛋白质含量检测结果, 国标消化法为 97. 61 g/L±0. 57 g/L,高温消化法为 97. 65g/L ±0. 55 g/L,两种方法无显著差异( t = 0. 5762, P >0. 05)。样品氮含量结果: 国标消化法为 15. 6 g/L±0. 01 g/L,高温消化为 15. 6 g/L±0. 01g/L, 两种方法无显著差异( t =0. 8069, P >0. 05)。 将两种方法对蛋白标液和样品检测结果进行 回归分析(见图 2) ,得出Y =0. 9987 X +0. 0797 , R2 =0. 9999。
2. 2　实验组蛋白回收率检测 结果见表 1。相对 标准偏 差分别 为 1. 7%、 0. 8%、1. 7%和 1. 2%,两种分别加入 0 μ L、100 μ L、 400 μ L、50 g/L 的蛋白标准液的混合样品回收率分别 为: 98. 0%、97. 5%、98. 0%和98. 5%,平均为 98. 0%3　讨论 近年来,对样品中蛋白质含量检测的准确度要 求越来越高,特别是奶粉的“三聚氰胺”事件发生以 来,在对有关含氮的各检测方法中凯氏定氮法的标 准地位也再一次被确定。凯氏定氮法不仅是对含 氮的有机化合物定量的标准方法,也是蛋白质含量 测定最经典的方法,但其同时也存在操作步骤多, 耗费时间长等缺点。国标规定的凯氏定氮法测定 蛋白质含量时,其消化过程要求小火碳化,温度约 400℃,待 样品 呈澄 清透 明后 再继 续大 火 消化 30 min ,总消化过程需要 3～ 4 h ,整个蛋白检测过程 至少需要 6 h 的时间。

为了缩短检测时间,本实验室采用高温持续消 化的方法代替国标的小火碳化消化法,使加热温度 保持在1 000℃左右,使消化液处于持续沸腾状态, 同时产生的蛋白质泡沫又不溢出瓶口。高温消化 法使消化过程缩短为 1 h 左右,使整个蛋白检测过 程缩短为 3～ 4 h。 通过高温和小火碳化两种消化方法对样本蛋白含量进行检测并比较,结果显示: 两种测定方法 在稳定性、准确性方面无显著差异。两种方法比较 的回归分析显示斜率为 0. 9987,接近于 1. 00,显示 出的比例分析误差是 0. 13%,这种误差相当于在 50 g/L为-0. 065 g/L,在 100 g/L 为-0. 065 g/L。Y 轴截矩接近于 0,表明固有系统误差很小,符合实验 要求。回收率测定 x =98. 0%,即相当于 2%的比 例误差。这一误差小于实验允许的总误差,再次验 证了该方法具有良好的准确性。 但本实验室经多次试验与统计学分析发现,高 温消化方法并不适用于免疫球蛋白含量较高的样 品的蛋白含量检测,其原因有待于进一步探索。

综上所述,本研究揭示高温消化方法检测蛋白 含量结果准确、快速,较国标规定的方法大大缩短 了工作时间,提高了工作的效率,适于广泛推广。